一枝蒿中一枝蒿酮酸的含量高效液相色谱法测定

发布时间：2019/11/22 9:52:56     浏览次数：1805

【关键词】  一枝蒿 一枝蒿酮酸 高效液相色谱法

目的建立新疆一枝蒿中一枝蒿酮酸含量测定的方法。方法采用高效液相色谱法（HPLC），SupelcosilTMLC18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm），流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50）；流速0.8 ml・min-1，柱温30℃，检测波长243 nm。结果一枝蒿酮酸和其他组分可达基线分离，线性范围0.042 4～0.212 0 μg（r = 0.999 6），平均回收率为96.4 %，方法精密度RSD=2.5%（n=3)。结论该法操作简便快速、准确灵敏，分离效果好，可为新疆一枝蒿质量控制提供方法依据。

　　Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for determining rupestonic acid in Artemisia rupestris L. growing in Xinjiang. MethodsA SupelcosilTMLC18 column (4.6 mm×250 mm,5 μm) and mobile phase consisted of methanol-0.4% phosphoric acid solution (50:50) were used at the column temperature of 30℃. The flow rate was 0.8 ml・min-1 and detection wavelength was 243 nm.ResultsThe quantity of rupestonic acid in the range of 0.042 4～0.212 0 μg versus peak area was linear (r = 0.999 6). The average recovery was 96.4 %, and method precision was 2.8% (RSD=2.8%, n= 6). ConclusionThe method is  simple, quick, accurate, high sensitive and suitable for quality control of Artemisia rupestris L. growing in Xinjiang.

　　Key words：Artemisia rupestris L.;  Rupestonic acid;  HPLC

　　新疆一枝蒿Artemisia rupestris L.系菊科蒿属植物岩蒿的全草，为多年生草本，生长在海拔1 100～2 900 m的地区，分布于中国新疆、中亚和欧洲等地［1］。一枝蒿是新疆哈萨克族和维吾尔族民间传统用药，国内临床资料表明，它具有解毒、健胃消食、抗过敏、抗菌、抗病毒及保肝等功效［2～4］；自古以来新疆流传着“家有一枝蒿，百病都除掉”的民间谚语，一枝蒿用于治疗毒蛇咬伤、荨麻疹、消化不良、跌打红肿、感冒发烧、咽喉肿痛等症。以一枝蒿为主药的复方制剂，已针对感冒和过敏性鼻炎等症上市销售。一枝蒿中含有黄酮类、酮酸类、氨基酸类、苷类、多糖类、挥发油类、多肽和生物碱类等化学成分［5］，其中倍半萜成分――一枝蒿酮酸含量较高［6］，以该化合物作为药材对照品能够较好的控制药材质量，且倍半萜类成分大多具有抗肿瘤等多种生物活性。文章建立一枝蒿酮酸的含量测定方法，简便易行，准确可靠，可为一枝蒿药材及相关产品的质量控制奠定基础。

　　1  仪器与试药

　　Agilent 1100高效液相色谱仪，惠普化学工作站；BS110S电子天平（德国 Sartorius）；SB3200超声振荡仪（上海Branson）。一枝蒿酮酸对照品（自制，纯度99%以上）；甲醇（色谱纯）；95%乙醇（分析纯）；磷酸（分析纯）；重蒸水；一枝蒿药材购于新疆维吾尔医研究所，品种由新疆药品检验所苏来曼主任药师鉴定。

　　2  色谱条件

　　色谱柱为SupelcosilTMLC18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液（50:50）；流速0.8 ml・min-1；柱温30 ℃；检测波长243 nm。

　　3  方法与结果

　　3.1  溶液制备

　　3.1.1  对照品溶液制备精密称取一枝蒿酮酸对照品5.3 mg,置5 ml 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，4℃保存，临用前吸取0.2 ml置10 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成21.2 μg・ml-1的对照品溶液。

　　3.1.2  供试品溶液制备取干燥一枝蒿全草适量，研成粗粉，精密称取50 mg,置10 ml 量瓶中，加95% 乙醇适量，超声提取20 min，放置室温，添加少量95%乙醇至刻度，摇匀，静置后精密吸取2 ml置10 ml量瓶中，添加95%乙醇至刻度，进样前经0.45 μm 微孔滤膜过滤。

　　3.2  系统适用性实验取含量为21.2 μg・ml-1对照品溶液进样,以一枝蒿酮酸计理论板数不低于6 000 ,峰形对称，色谱分离良好，杂质对检测无干扰。色谱图见图1。

　　3.3  进样精密度实验取一枝蒿酮酸对照品溶液  4 μl分别进样5次，峰面积的RSD=1.1 %。取样品溶液10 μl分别进样5次，一枝蒿酮酸峰面积的RSD=1.8 %。

　　3.4  线性关系考察精密吸取一枝蒿酮酸对照品溶液2，4，6，8和10 μl，分别进样测定，以一枝蒿酮酸峰面积对进样量(μg)进行线性回归，得方程为：Y= 3.920×103X-28.39 (r=0.999 6 )。一枝蒿酮酸在0.042 4～0.212 0 μg 范围内有良好的线性关系。

　　3.5  重复性实验取同一批次样品，按“3.1.2”项下方法制备6 份样品溶液，按“色谱条件”项下方法测定，一枝蒿酮酸峰面积的RSD=2.2 %(n=6)。

　　3.6  稳定性实验取供试品溶液1 份，室温放置，分别于0，2，4，6，8 h进样，测得峰面积并计算RSD=2.5 %（n= 5），说明供试品溶液在8 h内稳定。

　　3.7  加样回收率实验取一枝蒿全草粉末50 mg 共3份，按“3.1.2”项下方法处理后，分别加入对照品溶液（106 μg・ml-1）0.50，0.75和1.00 ml， 按“色谱条件”项下方法操作和测定，一枝蒿酮酸回收率为96.4 %，RSD=2.5 %（n= 3）。

　　3.8  样品测定分别取一枝蒿花、茎、叶和全草粉末各5份，按供试品溶液制备方法处理，吸取供试品溶液10 μl进行测定，用外标法计算一枝蒿酮酸的含量。结果见表1。表1  一枝蒿不同部位一枝蒿酮酸含量（略）

　　4  讨论

　　测定结果发现，一枝蒿酮酸在一枝蒿的不同部位分布不同，在花和叶中含量较高，超过了1%，而茎中含量较低，只有0.04%。一枝蒿是全草入药，其中茎的下部为木质，重量较大，因此，使一枝蒿酮酸在全草中的含量有所降低。

　　一枝蒿酮酸是倍半萜类化合物，虽然结构中含有极性较大的羧基，但其水溶性却很差，易溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，样品处理过程中水对其提取效率很低，而乙醇对其则有较好的提取效果。

　　一枝蒿酮酸含量测定的色谱条件为甲醇-磷酸水溶液，峰形对称，分离度好，其他杂质对测定没有干扰，但温度对测定有着十分大的影响，当柱温上升5 ℃，则保留时间会随着测定的进行逐步提前，直至无法测定，将温度控制在30 ℃时，保留时间才能较好的稳定下来。